কিভাবে Acrylamide জেল প্রস্তুত: 13 ধাপ (ছবি সহ)

2023 লেখক: Virginia Parson | [email protected]. সর্বশেষ পরিবর্তিত: 2023-11-26 18:19

অ্যাক্রিলামাইড জেলগুলি ইলেক্ট্রোফোরেসিসের একটি মূল উপাদান, আকারে বিভিন্ন ধরণের অণুর বিচ্ছেদ জড়িত একটি প্রক্রিয়া। এগুলি প্রায়শই রাসায়নিক যৌগ অ্যাক্রিলামাইড এবং বাইসাক্রিলামাইড, একটি উপযুক্ত পিএইচ বাফার, মুক্ত র্যাডিকেলের উত্স এবং একটি বিশেষ স্টেবিলাইজার নিয়ে গঠিত, যা পলিমারাইজেশনকে কিকস্টার্ট করতে সহায়তা করে। একবার একটি জেল শক্ত হওয়ার সময় পেয়ে গেলে, এটি ডিএনএ, আরএনএ এবং বিভিন্ন প্রোটিন গঠন বিশ্লেষণ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।

ধাপ

3 এর মধ্যে 1 অংশ: একটি সমাধানকারী বা স্ট্যাকিং জেল মেশানো

ধাপ 1. ddH এর একটি উপযুক্ত বেস পরিমাণ যোগ করুন₂একটি 10ml শঙ্কু শিশি

ডিডিএইচ সঙ্কুচিত করার জন্য একটি পাইপেট ব্যবহার করুন₂আস্তে আস্তে আপনার শিশি মধ্যে। আপনি যে রেসিপিটি অনুসরণ করছেন তার চেয়ে বেশি বা কম পরিমাণে যোগ না করার বিষয়ে সতর্ক থাকুন, যা আপনি বিশ্লেষণ করতে চান এমন বিশেষ ফর্ম্যাটের (প্রোটিনের ধরণ) উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হবে।

• "ডিডিএইচ₂O "হল" ডাবল ডিস্টিলড ওয়াটার "এর রাসায়নিক সংক্ষিপ্ত রূপ, যা জলকে সংবেদনশীল পরীক্ষাগার অ্যাপ্লিকেশনের জন্য উপযুক্ত স্তরে বিশুদ্ধ করা হয়েছে।
• একটি 12% চলমান জেল তৈরি করতে, উদাহরণস্বরূপ, আপনি 1, 650μl ddH দিয়ে শুরু করবেন₂O. একটি মাইক্রোলিটার (μl) একটি খুব ছোট তরল পরিমাপ যা লিটারের এক মিলিয়ন ভাগের সমান।

পদক্ষেপ 2. সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট (SDS) এর উপযুক্ত ঘনত্বের সাথে অনুসরণ করুন।

আপনার মিশ্রণ শিশিতে SDS স্থানান্তর করার জন্য একটি পৃথক, পরিষ্কার পিপেট ব্যবহার করুন। এসডিএস আপনার পরীক্ষার প্রোটিনগুলির অভ্যন্তরীণ চার্জকে "মুখোশ" করবে, যা তাদের সবাইকে একই রকম চার্জ-টু-ভর অনুপাত দেবে। যখন একটি বৈদ্যুতিক ক্ষেত্র জেল প্রয়োগ করা হয়, এটি বিভিন্ন প্রোটিন তাদের ভর উপর ভিত্তি করে বিভিন্ন হারে অ্যানোডের দিকে স্থানান্তরিত করবে।

প্রতিবার যখন আপনি জেলটিতে একটি নতুন উপাদান যুক্ত করেন তখন একটি তাজা পাইপেটে যান।

ধাপ 3. 30% অ্যাক্রিলামাইড দ্রবণ অন্তর্ভুক্ত করুন।

একটি আদর্শ অ্যাক্রিলামাইড দ্রবণ অ্যাক্রিলামাইড বিচ্ছিন্ন করে যা অতি বিশুদ্ধ পানিতে প্রবেশ করে। অ্যাক্রিলামাইড দ্রবণ প্রোটিন এবং নিউক্লিক অ্যাসিড বিচ্ছেদের জন্য ম্যাট্রিক্স হিসেবে কাজ করবে।

প্রয়োজনে, আপনি 30% (w/v) অ্যাক্রিলামাইড এবং 1.0% N, N′-methylene-bisacrylamide একসঙ্গে জলের যথাযথ সংমিশ্রণে তৈরি করতে পারেন।

সতর্কতা:

আপনি যখনই অ্যাক্রিলামাইড এবং বাইসাক্রিলামাইড মিশ্রণের সাথে কাজ করছেন তখন সর্বদা গ্লাভস পরুন। উভয় সমাধান হল নিউরোটক্সিন যা খালি ত্বকে শোষিত হলে মারাত্মক ক্ষতিকর পরিণতি হতে পারে।

ধাপ 4. প্রয়োজনীয় পরিমাণ 1.5M Tris-HCI pH 8.8 যোগ করুন।

আবার, একটি তাজা পিপেট ব্যবহার করুন এবং সুনির্দিষ্ট পরিমাণ যোগ করার জন্য সতর্ক থাকুন। Tris-HCI এর সংযোজন নিশ্চিত করবে যে আপনার জেল মিশ্রণের অন্তর্নিহিত উপাদানগুলি একটি ধ্রুবক pH- তে থাকবে।

Tris-HCI (সংক্ষেপে "tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride") হল এক ধরনের বাফার যা সাধারণত রাসায়নিক পদ্ধতি এবং পরীক্ষায় ব্যবহৃত হয়।

ধাপ 5. 10% অ্যামোনিয়াম পারসালফেট (এপিএস) প্রবেশ করান।

এপিএস একটি শক্তিশালী অক্সিডাইজিং এজেন্ট যা ঘন ঘন পলিমার রসায়নে সহ-অনুঘটক হিসাবে ব্যবহৃত হয়। TEMED এর পাশাপাশি, এটি পলিমারাইজেশন শুরু করার জন্য অপরিহার্য, একটি জটিল বন্ধন গঠনের প্রক্রিয়া যার ফলে তরল মিশ্রণটি একটি জেলে পরিণত হবে।

সেরা ফলাফলের জন্য, প্রতিবার যখন আপনি অ্যাক্রিলামাইড জেল নিক্ষেপ করবেন তখন এপিএস সমাধানের একটি নতুন ব্যাচ প্রস্তুত করুন।

পদক্ষেপ 6. প্রতিক্রিয়া অনুঘটক করার জন্য সর্বশেষ টেট্রামাইথাইলথাইলেনডিয়ামিন (TEMED) যোগ করুন।

একবার আপনি আপনার বাকি উপাদানগুলিকে একসাথে আনা শেষ করার পরে, উপরে TEMED চেপে ধরুন। TEMED হল জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিসে ব্যবহৃত প্রাথমিক অনুঘটক। এটি মিশ্রণে প্রবেশ করার সাথে সাথে পলিমারাইজেশনকে কিকস্টার্ট করবে, তাই এটি যুক্ত করার সাথে সাথে আপনার জেলটি নিক্ষেপ করার জন্য প্রস্তুত থাকুন।

• TEMED কে সর্বশেষ যুক্ত করা গুরুত্বপূর্ণ, যেহেতু এটি গতিতে প্রতিক্রিয়া নির্ধারণের জন্য দায়ী।
• এখানে বর্ণিত পদ্ধতি (পাশাপাশি সংযোজনের ক্রম) স্ট্যাকিং জেল প্রস্তুত করার জন্যও পুনরাবৃত্তি করা যেতে পারে-একমাত্র পার্থক্য হবে প্রতিটি উপাদানের সঠিক পরিমাণ।

3 এর অংশ 2: কাস্টিং যন্ত্রপাতি একত্রিত করা

ধাপ 1. পাতলা প্লেটটি মোটা প্লেটের উপর রাখুন এবং দুটি প্লেটের প্রান্ত সারিবদ্ধ করুন।

জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দুটি পৃথক কাচের প্লেট দিয়ে গঠিত একটি আবরণের ভিতরে সঞ্চালিত হয়, যার একটি অন্যটির তুলনায় কিছুটা মোটা। এই আবরণটি নির্মাণ শুরু করতে, "লম্বা" প্লেটের উপরে "ছোট" প্লেটটি উপরে পাতলা প্লেট দিয়ে স্ট্যাক করুন।

দুটি প্লেটের পুরুত্ব অন্তর্নির্মিত স্পেসারগুলির বৈশিষ্ট্য যা পাতলা প্লেটের বিপরীতে বিশ্রাম নেওয়ার সময় একটি সরু চেম্বার তৈরি করে।

ধাপ 2. কাস্টিং ফ্রেমের উপরের স্লটে স্ট্যাক করা প্লেটগুলি স্লাইড করুন।

সংক্ষিপ্ত প্লেটটি ফ্রেমের সামনের দিকে মুখ করা উচিত, লম্বা প্লেট এবং বিপরীত দিক থেকে দৃশ্যমান স্থানগুলি। একবার প্লেটগুলি ফ্রেমের ভিতরে বিশ্রাম নিলে, ফ্রেমের উভয় পাশে হিংড "গেটস" দুলিয়ে তাদের জায়গায় আটকে দিন।

• সারিবদ্ধ প্লেটের জোড়া দ্বারা গঠিত নিচের প্রান্তটি কাস্টিং ফ্রেমের নিচের অংশ এবং অন্তর্নিহিত কাজের পৃষ্ঠ উভয়ের সাথেই সমান্তরাল কিনা তা নিশ্চিত করুন।
• কাস্টিং ফ্রেমটি সাধারণত সবুজ প্লাস্টিক থেকে তৈরি করা হয়, যা তা অবিলম্বে বাকি যন্ত্রপাতি থেকে আলাদা করে তোলে।

ধাপ 3. কাস্টিং স্ট্যান্ডের শরীরে কাস্টিং ফ্রেম সেট করুন।

স্ট্যান্ডের উপরে U- আকৃতির ক্ল্যাম্পটি তুলুন, ফ্রেমটি সংক্ষিপ্ত প্লেট দিয়ে বাহিরের দিকে োকান, তারপর ফ্রেমটি লক করার জন্য এটি আবার কম করুন। স্ট্যান্ডের ভিতরে ফ্রেম সরে যাচ্ছে না বা ঘুরছে না তা নিশ্চিত করতে দুই টুকরার মধ্যে সংযোগ পরীক্ষা করুন।

একবার একত্রিত হয়ে গেলে, আপনার জেল মিশ্রণে পাইপ করার জন্য দুটি প্লেটের মধ্যে যথেষ্ট স্থান থাকা উচিত।

টিপ:

আপনি যদি চান, আপনি প্লেটগুলির মধ্যে ফাঁকে প্রায় 1 মিলিলিটার (0.034 fl oz) ডিওনাইজড পানিকে পাইপ করে সম্ভাব্য লিকের জন্য চেম্বারটি পরীক্ষা করতে পারেন। যখন আপনি সন্তুষ্ট হন, অতিরিক্ত সাবধানে পানি ভিজিয়ে রাখতে সাবধানে জল নিষ্কাশন করুন বা ফিল্টার পেপারের একটি শীট ফাঁক করুন।

3 এর অংশ 3: আপনার জেল ালা

পদক্ষেপ 1. চেম্বারের শীর্ষে খোলার মধ্যে আপনার তরল জেল মিশ্রণটি পাইপ করুন।

মিশ্রণটি যোগ করার জন্য একটি কাচের পিপেট এবং বাল্ব ব্যবহার করুন যতক্ষণ না এটি কাচের আবরণের বাইরে নির্দেশিত ভরাট লাইনের সাথে থাকে। কেসিংয়ের ভিতরে আপনি যে কোনও বায়ু বুদবুদ দেখতে পাচ্ছেন তা নিয়ে চিন্তা করবেন না-আপনি জেলকে পুরোপুরি পলিমারাইজ করার অনুমতি দেওয়ার আগে আপনি তাদের সাথে আচরণ করবেন।

যদি আপনি যে সরঞ্জামগুলি ব্যবহার করছেন তাতে যদি ফিলিং লাইন না থাকে, তাহলে কাস্টিং ফ্রেমের ভিতরে দৃশ্যমান কাচের "জানালার" উপরে থেকে প্রায় 1 সেন্টিমিটার (0.39 ইঞ্চি) পরিমাপ করুন এবং অনুভূত-টিপযুক্ত মার্কার ব্যবহার করে সেখানে একটি চিহ্ন তৈরি করুন।

পদক্ষেপ 2. মিশ্রণটি ডিগাস করতে ইথাইল অ্যালকোহল, আইসোপ্রোপানল বা এন -বুটানল এর একটি স্তরে েলে দিন।

আপনার পছন্দের অ্যালকোহলের সাথে একটি তাজা পিপেট পূরণ করুন এবং মসৃণ পিছন-পিছন গতি ব্যবহার করে চেম্বারে অল্প অল্প করে চেপে ধরুন। অ্যালকোহল usingালতে থাকুন যতক্ষণ না এটি আবরণের ভিতরে অবশিষ্ট স্থান পূরণ করে, প্রায় 1 সেন্টিমিটার (0.39 ইঞ্চি)।

• অ্যালকোহল ওভারলে সলিউশন কেবল আটকে থাকা অক্সিজেনকে দ্রবীভূত করতে সাহায্য করবে না বরং অন্য যে কোনও পরিবেশগত গ্যাসকে সমাপ্ত জেল মিশ্রণে প্রবেশ করতে বাধা দেবে।
• স্ট্যাকড জেলগুলিকে ডিগাস করার জন্য সাধারণত এটি প্রয়োজন হয় না, কারণ পৃথক স্তরগুলি একটি অবিচ্ছিন্ন ম্যাট্রিক্স হিসাবে কাজ করে, বিদ্যুতের প্রভাবে প্রোটিনের নমুনাগুলি জেলের মধ্য দিয়ে অবাধে স্থানান্তরিত হতে পারে।

বিকল্প:

আপনি APS এবং TEMED যোগ করার আগে ন্যূনতম 15-20 মিনিটের জন্য একটি ভ্যাকুয়ামের নিচে তরল জেল মিশ্রণটি দেগাস করুন।

ধাপ 3. ঘরের তাপমাত্রায় জেলটি ন্যূনতম 20-30 মিনিটের জন্য সেট আপ করার অনুমতি দিন।

এখন, যা করার বাকি আছে তা হল একটি টাইমার সেট করা এবং আপনার জেলটি আধা ঘন্টা বা তারও বেশি সময় ধরে অস্থিরভাবে বসতে দিন। এই সময়ের মধ্যে, এটি পলিমারাইজেশনের মধ্য দিয়ে শেষ হবে, ধীরে ধীরে একটি ঘন জেলে পরিণত হবে।

• পলিমারাইজিংয়ে ব্যস্ত থাকাকালীন, জেলটিতে কিছু যোগ করা বা অন্যথায় হস্তক্ষেপ করা এড়িয়ে চলা, ঝাঁকুনি দেওয়া এড়িয়ে চলুন।
• যদি সময় অনুমতি দেয়, আপনি আপনার বরাদ্দকৃত পলিমারাইজেশনের সময়কে 45-60 মিনিট পর্যন্ত বাড়িয়ে দিতে পারেন, শুধু নিশ্চিত হওয়ার জন্য যে জেলটি পুরোপুরি শক্ত হওয়ার সুযোগ পেয়েছে।

ধাপ 4. আপনার জেল সেটিং সম্পন্ন হলে অ্যালকোহল ওভারলে সমাধান নিষ্কাশন বা শোষণ করুন।

অ্যালকোহল কে রাসায়নিক সিংক বা উপযুক্ত তরল বর্জ্য নিষ্কাশন পাত্রে ourেলে দিন, অথবা ফিল্টার পেপারের একটি শীট ব্যবহার করুন। আপনার কাছে এখনই আপনার জেল ব্যবহার করা বা ভবিষ্যতে বিশ্লেষণের জন্য এটি সংরক্ষণ করার বিকল্প রয়েছে।

কিছু রসায়নবিদ ক্যাস্টেড জেলের উপরের পৃষ্ঠটি অল্প পরিমাণে ডিওনাইজড জল দিয়ে ধুয়ে ফেলার পরামর্শ দেন।

পরামর্শ

• এরলেনমেয়ার ফ্লাস্কগুলি অ্যাক্রিলামাইড সলিউশন এবং জেল মিশ্রণের জন্যও দরকারী, কারণ তাদের ট্যাপার্ড ঘাড়গুলি সম্ভাব্য বিষাক্ত ধোঁয়ার পরিমাণ সীমাবদ্ধ করে যা পালানোর অনুমতি দেয়।
• আপনি একটি কাস্টিং শুরু করার আগে আপনার কাচের প্লেটগুলি পরিষ্কার এবং ফাটল, চিপস বা অন্যান্য ক্ষতি মুক্ত কিনা তা নিশ্চিত করুন।

সতর্কবাণী

• অ্যাক্রিলামাইডের সাথে কাজ করার সাথে জড়িত কিছু ঝুঁকির মধ্যে রয়েছে স্নায়ুতন্ত্রের বিষক্রিয়া, প্রজনন অঙ্গের ক্ষতি বা অস্বাভাবিক প্রভাব, হরমোন উৎপাদনে হস্তক্ষেপ এবং ক্যান্সারের ঝুঁকি বৃদ্ধি।
• ইলেক্ট্রোফোরেসিস জেল তৈরিতে ব্যবহৃত অনেক রাসায়নিক পদার্থ বিভিন্ন মাত্রায় কাস্টিক এবং যদি তারা আপনার ত্বকের সংস্পর্শে আসে তবে হালকা থেকে গুরুতর জ্বালা সৃষ্টি করতে পারে।